Biotech Spain  Técnica

Fecha de publicación: 28/09/2010

Última actualización: 25/04/2011

Número de visitas: 45097

Sistemas de expresión de proteínas recombinantes (II). Organismos productores.

El vector de expresión es elegido normalmente en combinación con el sistema de expresión a utilizar. Actualmente, se pueden sintetizar proteínas recombinantes en organismos vegetales y animales, tanto procariotas como eucariotas. Las proteínas recombinantes pueden ser expresadas en cultivos celulares de bacterias, levaduras, hongos, mamíferos, plantas e insectos. También se han desarrollado animales y plantas transgénicos para la producción de proteínas de interés.

 

Para todas estas posibilidades se han desarrollado vectores, muchos de ellos disponibles comercialmente. Todos tienen ventajas e inconvenientes, y la elección de uno u otro viene determinada por los requerimientos de la proteína a expresar. 

 

Esto es así porque la actividad adecuada de una proteína es el resultado de una síntesis sin errores, acompañada de la generación de una estructura propia que puede requerir  modificaciones posteriores a la síntesis de la cadena polipeptídica, como la formación de puentes disulfuro o la glicosilación de determinados aminoácidos.

 

 

Síntesis en bacterias

Los microorganismos más utilizados para la síntesis de proteínas recombinantes son las bacterias, más concretamente la especie Escherichia coli. Esta bacteria es fácil de cultivar y de modificar genéticamente. A nivel de síntesis de proteínas, es un trabajador rápido y de alto rendimiento, y puede acumular proteínas recombinantes en una proporción que puede llegar hasta el 80% de su peso seco, lo que hace que sea la primera posibilidad que se tiene en cuenta cuando se quiere expresar proteínas recombinantes.

Las bacterias son ideales para producir proteínas de pequeño tamaño que no requieran modificaciones postraduccionales. Pero al ser procariotas, no son tan idóneas para sintetizar proteínas de gran tamaño o procedentes de organismos superiores. Éstas últimas a menudo muestran plegamientos complejos que incluyen muchos puentes disulfuro o que necesitan la intervención de chaperonas celulares en el plegamiento, características no presentes en los procariotas. Además, muchas de estas proteínas requieren para su función la inclusión de modificaciones tras su síntesis, que no pueden llevarse a cabo en organismos procariotas. Un ejemplo de ello es la glicosilación, esencial para la función de muchas proteínas eucariotas.

Un efecto colateral experimentado por las bacterias cuando son forzadas a producir una proteína a concentraciones elevadas es la generación de cuerpos de inclusión, que no son más que agregados citoplasmáticos insolubles de dicha proteína. Las proteínas que forman los cuerpos de inclusión son inactivas y además suelen mostrar artefactos estructurales, como puentes disulfuro no nativos, tanto intra como intermoleculares y cisteínas libres no habituales. Para estos casos se han desarrollado métodos de procesamiento de cuerpos de inclusión, con el fin de aislarlos, solubilizarlos con agentes desnaturalizantes, eliminar los puentes disulfuro y renaturalizar la proteína a su forma activa.

Como alternativa  se han desarrollado también aproximaciones para reducir la producción de  cuerpos de inclusión, que incluyen el direccionamiento de la proteína hacia el espacio periplásmico y el crecimiento de las bacterias a temperaturas inferiores a las estándar.

Los bacilos Gram-positivos (género Bacillus) son también buenos productores de proteínas a nivel bacteriano. Además, no producen cuerpos de inclusión, no generan exo ni endotoxinas (lo cual los hace interesantes para la producción de proteínas de utilidad médica) y suelen excretar las proteínas sintetizadas directamente al medio de cultivo, facilitando mucho su posterior purificación.  Una desventaja de estos microorganismos es la generación de gran cantidad de proteasas que a veces destruyen la proteína que se quiere producir.

 

Las levaduras.

Las levaduras presentan muchas de las ventajas en cuanto a crecimiento de las bacterias (alto rendimiento, estabilidad de la cepa productora, crecimiento a alta densidad, productividad, crecimiento en medios baratos y químicamente definidos). Pero además, como buenos eucariotas, son capaces de glicosilar y de plegar proteínas complejas, incluyendo aquellas que tienen un número elevado de puentes disulfuro, ya que su proceso de producción es muy similar al de las células de mamífero. La adición de una secuencia señal en el gen permite la excreción de la proteína al medio de cultivo Además, algunas levaduras, como S. cerevisiae, tienen una larga historia de utilidad en procesos de fermentación industrial.

Otro aspecto en el que las levaduras se muestran como valiosos productores de proteínas recombinantes es la disponibilidad de algunos promotores muy fuertes y de regulación muy precisa, sobre todo en las levaduras metilotrofas, como Pichia, Candida, o Hansenula. Entre otras ventajas de los metilotrofos ya explotadas o en estudio,  destacan su capacidad para crecer en soluciones de metanol, eliminando virtualmente otros microorganismos competidores o contaminantes y la posibilidad de integrar múltiples copias del vector en su genoma, dando lugar a transformantes estables.

 

Sistemas de expresión en células de insecto.

La inmensa mayoría de polipéptidos excretados por eucariotas están glicosilados, pero hay que tener en cuenta que el patrón de glicosilación de un determinado polipéptido es específico de especie, tejido y célula. De hecho se habla muchas veces de la glicosilación como un nivel adicional de especificidad en ciertas interacciones protéicas.

La glicosilación no siempre es necesaria para la actividad de una proteína (por ejemplo, el gamma-interferón comercial producido en bacterias no está glicosilado), pero hay casos en los que es esencial;  de hecho, es la razón por la que muchos anticuerpos producidos en bacterias no reconocen su diana eucariota. Más aún, pueden darse casos de hiperglicosilación, como ocurre a menudo en S. cereviseae, que también pueden influir negativamente en la actividad de la proteína a producir. Por esta razón, las levaduras a veces “se quedan cortas” en su capacidad de modificación postraduccional.

Las células de insecto son capaces de llevar a cabo modificaciones postraduccionales mucho más complejas que las levaduras, abarcando no sólo glicosilaciones más perfectas, sino también fosforilaciones, procesamiento de péptidos señal, procesamientos proteolíticos correctos, acilaciones, carboximetilaciones, etc.  Procesan los puentes disulfuro correctamente y además muestran altos niveles de expresión. Además, tienen la mejor maquinaria disponible para el plegamiento de proteínas de mamífero (aparte de los propios mamíferos), por lo que son especialmente interesante para la producción de proteínas solubles de este origen.

Las células de insecto son transformadas mediante vectores basados en baculovirus, que son virus patógenos específicos de insectos y otros artrópodos.  Un vector de este tipo infecta fácilmente cultivos de células larvarias de insectos de manera muy específica. Los vectores de insecto aprovechan el fuerte promotor de la polihedrina del virus, una proteína no esencial para la infectividad del virus y que puede eliminarse sin problemas del constructo.

Entre las desventajas de este sistema de expresión se cuentan la necesidad de establecer empíricamente los patrones de procesamiento postraduccional para cada construcción, la necesidad de añadir en determinados casos señales específicas de insecto para asegurar la secreción, la presencia de agregados o proteínas incorrectamente plegadas y fallos en la glicosilación, ya que a pesar de ser mejor que en levaduras, en muchos casos no es la requerida para el correcto funcionamiento de la proteína.

 

Las células de mamífero como factorías de producción.

Obviamente, si se necesita una modificación postraduccional específica de mamífero, un entorno mamífero sería la mejor opción.  El uso de cultivos celulares de mamífero, concretamente de células de ovario de hámster chino (CHO) comenzó en los primeros tiempos de la biofarmacéutica, a raíz de la necesidad de producir eritropoyetina y activador tisular de plasminógeno. Desde entonces, las células CHO se han constituido como los sistemas preferidos para la producción de anticuerpos monoclonales y otras proteínas recombinantes.

El número y especie de células productoras ha ido aumentando con el tiempo. Actualmente se utilizan mielomas de ratón (NS0), de riñón de hámster (BHK), de simio y de humano (BHK). Los biofármacos producidos a partir de sistemas de mamífero alcanzaron en 2006 ventas superiores a los 20 millones de dólares. Entre las especies moleculares producidas se cuentan hormonas (como la gonadotropina coriónica o la hormona luteinizante) y anticuerpos, quizá las proteínas de más difícil expresión a gran escala, debido a sus requerimientos de plegamiento y glicosilación.

Si bien parecen ser las únicas opciones viables para proteínas complejas en las que la estructura y posterior modificación son críticas, los sistemas basados en cultivos celulares adolecen de un rendimiento bajo comparado con los procariotas y las levaduras. Además, el cultivo y mantenimiento de cultivos celulares de este tipo es caro, al requerir condiciones más restrictivas en cuanto a ambiente y sistema de cultivo. Esto repercute en el precio final del producto. Validar las plantas de producción de estos sistemas es también caro y presenta requerimientos adicionales de bioseguridad para conseguir la aprobación por parte de las agencias reguladoras, ya que cualquier contaminante de un cultivo celular de mamífero es susceptible de pasar al paciente que recibe la medicación.

 

Animales transgénicos.

Los animales superiores producen secreciones susceptibles de ser utilizadas como vehículo para la expresión de proteínas heterólogas. De hecho, se están utilizando animales transgénicos que producen proteínas recombinantes en  la leche, la clara de huevo, la sangre, la orina, el plasma e incluso en los capullos de seda. La idea básica es sencilla: aprovechar los mecanismos de producción de estos fluidos para incluir en los mismos la proteína de interés, con la ventaja de una purificación sencilla y un bajo coste. Además, en la mayoría de los casos la proteína producida es tan activa como la nativa.

El uso de las glándulas mamarias para producir proteínas en la leche ha sido uno de los más explorados. Normalmente, la proporción de proteína recombinante con respecto a la total de la leche es baja.  Pero, haciendo algunos números, si tenemos en cuenta que una vaca puede producir en un día treinta litros de leche, con 35 gramos de proteína total por litro (o sea, un kilo de proteína por día), una producción de proteína de interés de sólo dos gramos por litro se traduce en unos asombrosos diez kilos por año de proteína recombínate. Entre las proteínas producidas podemos contar el activador tisular de plasminógeno en leche de cabra, alfa-1-antitripsina en leche de oveja, o la proteína C humana en leche de cerdo.

Sin embargo, la generación de un animal transgénico es muy costosa. Se necesita personal muy cualificado e instalaciones especiales y además, las tasas de éxito son bajas. A nivel industrial, la desventaja principal en el caso de los animales transgénicos es el tiempo para asegurar niveles de producción que van desde los tres a los 32 meses dependiendo de la especi, tiempo en el cual hay que mantener a los animales sin que produzcan beneficios. Además hay que tener en cuenta los gastos en cuanto a alimentación e instalaciones para conseguir mantener una cabaña de animales sostenible en el tiempo, que además cumpla con los criterios de las agencias. Por todas estas razones, la industria de los animales transgénicos productores no ha sufrido el despegue esperado.

 

Las plantas transgénicas.

Las plantas, en comparación con los animales y los cultivos procedentes de animales, ofrecen una producción más segura y rápida, que requiere menos tiempo y es más ventajosa en términos de almacenamiento y distribución. En cuanto a seguridad, presentan menos riesgo de contaminación con patógenos animales, ya que no son infectadas por virus animales y los virus vegetales a su vez no son transmisibles al ser humano. El escalado es mucho más barato: se necesita únicamente agua, fertilizantes y sol para lograr cultivos a gran escala. Por si fuera poco, el producto es susceptible de producirse envasado de forma natural (en los frutos o las hojas) para su transporte y conservación estable. Las plantas son capaces incluso de producir proteínas complejas de varias subunidades, como anticuerpos funcionales. Otros productos que se han producido con éxito son la beta-D-glucuronidasa, la avidina y la tripsina, así como antígenos para vacunas como el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Sin duda la síntesis de proteínas recombinantes a partir de plantas es aún un camino en vías de explotación.

 

El mundo ha sido testigo e avances clave derivados de la ingeniería genética que están cambiando la industria farmacológica, alimentaria y médica. En el corazón de la producción de nuevos medicamentos y vacunas, de nuevos agentes de interés industrial, sanitario y medioambiental se encuentra la síntesis de proteínas recombinantes. Por ello, el desarrollo y evolución de nuevos sistemas de síntesis de estas proteínas será crucial en los próximos años para el sector biotecnológico. 

 

Autor: Vicente Díaz martínez, Mari Carmen Martos

Permalink: https://biotechspain.com/?iid=expresion_proteinas_recombinantes_ii&itid=5&lan=es

PDF